The Effects of Ripe Pistachio Hulls Hydro-alcoholic Extract and Aerobic Training on Learning and Memory in Streptozotocin-induced Diabetic Male Rats
A B S T R A C T
Introduction: Diabetes mellitus has harmful effects on body functions, such as learning and memory. According to the role of exercise and medicinal plants on body health, the purpose of this study was to survey the effect of combined aerobic training and the use of Ripe Pistachio Hulls (RPH) hydro-alcoholic extract on learning and memory in streptozotocin-induced diabetic male rats.
Methods: In this experimental study, 42 male Wistar rats weighing 250-280 g were used in 6 groups with an equal number of 7 rats in each one. Streptozotocin (STZ) (50 mg / kg)was used to induce diabetes , and the test protocol was applied for 8 weeks. Passive avoidance memory was assessed using a step-through passive avoidance apparatus (shuttle box). SPSS software was used to analyze the data and P<0.05 was significant. Results: The results showed that step-through latency in the acquisition trial (STLa) was not significantly different among groups. Step-through latency in retrieval (STLr 24) test significantly reduced and time spent in The Dark Compartment (TDC) decreased in treated groups compared with the diabetic control groups (P<0.001). Also, there was no significant difference between the STZ and saline diabetic groups. Conclusion: The findings of this study revealed that the RPH hydro-alcoholic extract and aerobic exercise could improve passive avoidance memory in streptozotocin diabetic rats. Meanwhile, they might be an adjuvant therapy combined with other traditional medicine.
1. Introduction
Diabetes mellitus is one of the most serious endocrine disorders. It is estimated that over 347 million people worldwide have suffered from this disease until 2011 (Danaei et al., 2011). The World Health Organization (WHO) has predicted that the number of people with diabetes will increase to 366 million in 2025 (Young et al., 1992). Also, the WHO reported that nearly 35.6 million people live with dementia. It is expected that this number might be doubled by 2030 (65.7 million), and it can reach more than triple rate by 2050 (115.4 million) (Ammari et al., 2018). The new lifestyle of urban living, lack of exercise, and unhealthy nutrition, along with the consumption of fatty and sweet foods, are among the factors that cause health damage, the development of metabolic diseases, and the loss of human life. One of the metabolic diseases is diabetes. It is an autoimmune disease, in which genetic factors, environmental stress, viral infections, and diet can bring about the destruction of the insulin-producing beta cells in the pancreas. Disruption of cognitive and nonnormalization of neurochemical compounds and brain structures in diabetic patients and rodent diabetic rats with streptozotocin (STZ) has been reported (Young et al., 1992; Ogonovszky et al., 2005). Furthermore, memory and learning, ability to solve problems, speed of exercise, mental and complex physical movements, inference, and understanding of the diabetic patients are damaged (Ramanathan & Jaiswal, 1998)
Many studies have been conducted on the treatment of diabetes using medicinal herbs. The protective effects of plant extracts, including cumin, fenugreek, sage, moss, etc. have been confirmed in diabetic rats (Shahbazi & Maleknia, 2008). Pistachio is one of the most widely used herbs in traditional medicine. Hull is the largest byproduct of pistachio (accounting for on average between 35% and 45%) during industrial post-harvest processing (Grace et al., 2016; Barreca et al., 2016). It was reported that ethanol extract of ripe pistachio hulls (RPH) contains a large diversity of phenolic acid, flavonoids, flavonols, flavones, and flavonols (Barreca et al., 2016). Based on its constituents, RPH could be a cost-effective source of compounds with health-protective potential. Also, RPH phenolic derivative might be used as a natural alternative to synthetic antioxidants (Grace et al., 2016; Sevcan, Ozlem, Reinhold, & Ralf, 2017). The role of flavonoids in memory enhancement has been shown (Nishimura, Taki & Takaishi, 2000). Aerobic exercises could improve memory and learning (Khalaj & Ahmadi, 2016). Also, physical activity has a critical role in blood glucose management and overall health in individuals with diabetes and pre-diabetes (Colberg et al., 2016). Over several decades, an exercise in human and animal models could help to maintain brain functions, such as cognitive performance, and it can even protect the central nervous system and improve learning/memory functions following chronic exercise (Yi, 2015). Because exercise and some medicinal plants can have beneficial effects on memory in diabetic rats, the present study was designed to investigate the effect of RPH hydro-alcoholic extract and aerobic exercise on learning and memory of STZ-diabetic male rats.
2. Materials and Methods
2.1. Chemicals and preparation of RPH hydro-alcoholic extract STZ was purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) and dissolved in saline. The ripe pistachio (Pistacia vera, L.) nuts of Ohadi cultivar were obtained from 13-year-old trees grown in the Damghan region of Semnan Province, Iran in 2013. The plants were authenticated by the associate professor Davood Bakhshi, a pomologist in the Faculty of Agriculture, University of Guilan, Rasht, Iran. The fleshy fruit wall of the fresh and ripe pistachios was removed and dried in an oven at 40°C. Fifty grams of the fine powder of RPH was mixed with 70% ethanol (70% ethanol and 30% distilled water) and placed on a shaker incubator with gentle shaking for 72 h. Afterward, the liquid phase of the container was placed on the funnel and then dried. The dried extract was weighed and resuspended in normal saline. Animals received an appropriate amount of extract according to their weight and protocol. Meanwhile, the administration of the extract in saline solution was carried out by the gavage method (10 ml/kg). Various doses of RPH hydro-alcoholic extract (1, 5, 10, 50, 100, and 500 mg/kg) were administered to rats by gavage for 2 months before training, and only the extract at a dose of 10 mg/kg significantly increased the STLr 24 h compared with the saline group (P<0.05) and there was a significant reduction in the TDC than the sham and saline groups (P<0.01 and P<0.05, respectively). Therefore, the dose of 10 mg/kg of the RPH extract was selected as an effective dose.
2.2. Animals In this experimental study, 42 male Wistar rats weighing 250-280 g were used (n=7 in each group) and kept at the Animal House of Guilan University of Medical Sciences at a temperature of 20±2°C and a light-dark cycle of 12 h (the start of lighting at 9 am and the start of darkness at 9 pm) four rats per cage with standard water and food available. All behavioral tests were conducted from 10:00 am to 4:00 pm. All animal experiments were carried out in accordance with the National Institute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (Publication No.: 85-23 revised in 1985). All protocols were also approved by ethical and supervisory guidelines of working with experimental animals of Guilan University of Medical Sciences (Code No.: IR.GUMS.REC.1395.27). The cages were cleaned twice a day, and during this time, animals were checked for their sugars, and if they reached the fetal border, they were injected with insulin. Rats were randomly divided into six groups of seven rats: (1) the sham group, which included non-diabetic rats and did not get any medicine or exercise (2) STZ group, which included diabetic rats that they did not get any medicine or exercise); (3) the diabetic group that received normal saline as the solvent of RPH (STZ+Saline); (4) the diabetic group that received RPH hydro-alcoholic extract (STZ+RPH); (5) the diabetic group that was subjected to running on the treadmill for 8 weeks and training for 24 h (STZ+exercise); and (6) the diabetic group that received RPH hydro-alcoholic extract plus aerobic exercises.
2.3. Induction of diabetes After controlling and recording the weight, the intravenous blood glucose of all animals was measured by using the Accu Check glucose meter, and the fasting blood glucose level was less than 200 mg/dl without fasting. Then, after 24 h of fasting, diabetes was induced by an intraperitoneal injection of STZ at a dose of 50 mg /kg (Firouzjaei, Jafari, Eskandari, Anarkoli, & Alipour, 2013). For injection, STZ was dissolved in cold saline (1 ml/kg) solution, injected at 8:00 am, and in fasting state to the rats. Three days (72 h) after STZ injection, blood glucose was monitored in animals. The criterion for diabetic rats was considered as a blood glucose level of above 250 mg/dl; therefore, other animals were excluded from the study (Firouzjaei, et al., 2013; Hasanein & Shahidi, 2012; Jabbarpour et al., 2014).
2.4. Aerobic exercises At first, rats passed the adaptation period by rat treadmill. During this period, recurring short-term training courses were used during four consecutive days (each training session included a 5-minute course of 10 m/ min daily). The untrained animals were eliminated after the adaptation period. One day of resting was considered, and then the main phase of training began. In the first week, animals ran a treadmill with a gradient of zero and a speed of 10 m/min for 10 min. In the second week, after 5 min running at a speed of 10 m/min, the speed reached 20 m/min with the same zero gradient and running for 10 min. This period of the practice continued for 8 weeks (Verma & Bordia, 1998). After a period of practice, animals of different groups were tested using standard devices for learning and memory.
2.5. Passive avoidance learning and memory After eight weeks of practice, the passive avoidance learning and memory of different diabetic groups of animals were evaluated using the Shuttle Box apparatus purchased from Borj Sanat Co. Long-term memory evaluation was based on negative reinforcement. This instrument had two compartments, the mechanical part, and the controller or the electronic part. Two chambers were separated by an 8 x 8 cm guillotine door. The dimensions of each chamber were 20×21×20 cm. On the floor of each of these two chambers, the bars (2.5 mm in diameter) are spaced 1 cm apart, which acts as a network for transporting electric shock to an animal. The control part determines the duration, frequency, and shock intensity. The habituation stage consists of two steps that take place at intervals of 30 min. At this stage, the rat was placed in a white chamber and the guillotine door was opened in 10 s and step-through latency was recorded until the animal entered the dark chamber. When the animal entered the dark chamber, the guillotine door was closed and the animal was taken out of the dark chamber, and after each stage, the animal was placed in its individual cage. The training took place 30 min after the second habituation stage. Thus, the rat was placed in the white chamber, and after 10 s, the guillotine door was raised. The Step-Through Latency (STL) of the animal was recorded and the electric current was fed to the animal’s paws for 1 sat a frequency of 50 Hz for 2 s and it was repeated 120 s later. When the rat did not enter the dark chamber, the test was stopped; however, the shock was delivered when the animal entered the dark chamber. After three tests, if the rat was not able to complete the task, it was removed from the test. This step was performed 24 h after training to assess long-term memory. The test lasted for 10 min. Two timers were used to record the desired time for the test. At first, the rat was placed in a white chamber and the guillotine door was opened after 10 s, and step-through latency of animal into the dark chamber was recorded. Finally, the total time spent in the dark chamber (TDC) was recorded for 10 min (Firouzjaei, et al., 2013). 2.6. Statistical analysis Data were analyzed using SPSS software. Data are shown as Mean±SEM. The Kolmogorov-Smirnov test was used to ensure the normal distribution of data. If the distribution was normal, the results were compared using the one-way analysis of variance (ANOVA), followed by the Tuckey’s post-hoc test; otherwise, the KruskalWallis statistical test was used. P<0.05 was considered as a significant level.
3. Results
3.1. The amount of step-through latency in acquisition trial (STLa) The results showed that the STLa increased in the sham, STZ+RPH, STZ+exercise, and STZ+RPH+exercise groups in comparison with the STZ and STZ+saline groups, but these changes were not significant.
3.2. Step-through latency in the retrieval (STLr) The 24-hour post-training memory test showed a significant difference between the groups in STLr (P<0.001). The intra-group comparison showed no significant difference between STZ and saline diabetic groups. On the other hand, there were significant differences in the STZ and saline diabetic groups compared with the sham, STZ+RPH, STZ+ exercise, and STZ+ RPH+exercise groups (P<0.001).
3.3. TDC Intra-group comparisons showed no significant difference between the STZ and saline diabetic groups. On the other hand, there were significant differences in the STZ and saline diabetic groups compared with the sham, STZ+RPH, STZ+exercise, and STZ+RPH+exercise groups (P<0.001).
4. Discussion
In the present study, the effect of RPH hydro-alcoholic extract and aerobic training on learning and memory in STZ-induced diabetic male rats was studied. The results of this study showed that aerobic exercise and RPH hydro-alcoholic extract alone or in combination improved learning and memory deficits in diabetic rats and the memory improvement in treated groups was significant compared with the diabetic control groups. STZ-induced diabetes reduces memory performance (Flores-Gómez, de Jesús Gomez-Villalobos, & Flores, 2018). In previous studies, learning and memory deficits have been reported in both diabetic humans and animals (Patil, Singh, & Kulkarni, 2006; Kucukatay,
Agar, Gumuslu, & Yargicoglu, 2007). In the memory test, in diabetic rats, the latency to enter the dark chamber (STLr) decreased and TDC increased, indicating memory impairment following diabetes mellitus. The increase in STLr cannot be attributed to the sensory or motor impairment of the animals. Because the value of STLa before the electric shock did not show a significant difference among the groups. In the present study, the shuttle box apparatus was used to measure passive avoidance memory. Feeding the hydro-alcoholic extract of RPH at a dose of 10 mg / kg caused a significant increase in STLr and a significant reduction in the TDC compared with the diabetic control groups. These results indicated that RPH extract improved memory impairment due to diabetes mellitus in rats. Phenolic compounds were found in the pistachio, with antioxidant, anti-inflammatory, and antimicrobial effects (Azadedel, Hanachi, & Saboora, 2017). In epidemiological studies, it was proven that phenolic flavonoids, as antioxidants in pistachio red peal, have improved memory performance in older rats (Mozdastan, Ebrahimzadeh, & Khalili, 2015). Pistachio red skin has a parenchymal and fibrous structure. It also consists of minerals, such as potassium, magnesium, calcium, and sodium. Meanwhile, flavonoids are important compounds in this plant, which could increase cholinergic activity (Zhang, Tang, Zheng, Chen, & Shen, 2011; Gao, Tang, He, & Bi, 2012) and learning and memory (Thirugnanasambantham et al., 1990; Savelev, Okello, & Perry, 2004). It was also proven that acetylcholine receptor stimulation increases memory and cognition (Baxter & Crimins, 2018), and it seems that RPH extract increased memory through the potentiation of the cholinergic system. The consumption of foods rich in polyphenols, including flavonoids, has a major impact on preserving brain function, improving learning and memory ability, and also contributes to the improvement of neuronal signaling in memory formation. Flavonoids have potent antioxidant and anti-inflammatory effects, which can slow down the process of reducing brain function due to aging. Flavonoids can improve blood flow to the brain and play an important role in increasing memory and learning ability. Possible mechanisms of the effects of flavonoids on brain function are effective processes for cell survival, differentiation, and memory formation. The mechanism of action of these compounds is different in the brain. Some act as estrogens and a group through neural signaling is involved in controlling morphological mechanisms that affect memory formation, resulting in enabling effective enzymes in these pathways to increase memory and learning ability (Van, Kempermann, & Gage, 1999). Flavonoid-rich plants and foods could improve memory and synaptic plasticity. Flavonoids play an important role in improving human memory and neurocognitive performances by the protection of vulnerable neurons, as well as the elevation of existing neuronal function and regeneration (Spencer, 2008; Viggiano et al, 2006; Wang, Wang, Wu, & Cai, 2006). In this study, exercise could improve passive avoidance memory deficiency due to diabetes. Also, RPH consumption potentiated the incremental effect of exercise on memory. Various studies have confirmed the beneficial effects of physical activity and exercise on brain functions, such as memory enhancement (Grealy, Johnson, & Rushton, 1999), cognitive function (Johansson & Ohlsson, 1996), neurogenesis (Ohlsson & Johansson, 1995), and improvement of brain injuries (Ogonovszky et al., 2005). Exercise, without adverse effects, prevents repression of cell proliferation due to STZ in the sinusoidal grooves of the brain, and somehow improves abnormalities and functions (Guo et al., 2008; Ding et al., 2005). Studies have shown that exercise improves brain resistance to injury and improves cognitive and motor processes (Radak et al., 2006; Spiegelman, 2013). Both structural and functional changes in the brain play an important role in improving memory and learning in response to exercise (Gordon, Benson, Bird, & Fraser, 2009). Since exercise induces neurogenesis in humans, it decreases the risk of Alzheimer disease (Henriksen, 2002), Parkinson disease, and some other neurogenic disorders (Henriksen, 2002;Yuede et al., 2009). Exercise reduces blood glucose, and this decrease after exercise is associated with the increased response of the cells to insulin and improved insulin function (Gordon, Benson, Bird, & Fraser, 2009). Previous studies have shown that exercise can increase the expression of glucose transporter (GLUT) proteins in skeletal muscle (Henriksen, 2002). Therefore, exercise via reducing blood glucose improves memory impairment by STZ. It has also been shown that exercise helps to change the antioxidant status of rats (Yuede et al., 2009). Regular and continuous exercise has beneficial effects on the brain. Accordingly, exercise increases capillary growth, dendritic connections, and processing in the central nervous system (Cotman & Berchtold, 2006). In addition, regular exercise reduces brain damage after stroke (Carro, Trejo, Busiguina, & Torres- Aleman, 2001) as well as the severity of many age-related illnesses. It has been shown that aerobic exercise prevents a decrease in the amount of gray matter and mental ability in the age-old cortex (Colcombe, et al., 2004; Blomquist & Danner, 1987; Evans et al., 1993). The long-term exercise results in an increase in the level of antioxidants and antioxidant enzymes that can protect the brain from oxidative damage; for example, after a long-term exercise, the levels of Malondialdehyde (MDA), a product of lipid peroxidation and oxidative stress biomarker, and ascorbic acid in the brain decreased and increased, respectively (Liu et al., 2000). Ascorbic acid, as a nerve modifier, improves memory and learning disorders caused by Alzheimer disease (Harrison, Hosseini, Dawes, Weaver, & May, 2009). Decreasing the BDNF mediates neurodegenerative disease such as Parkinson. Moderate to high intensity of training induces increase of BDNF receptors in the brain that prevents neurodegeneration (Małczyńska, Piotrowicz, Drabarek, Langfort, Małgorzata Chalimoniuk, 2019). Exercise through reducing the blood glucose helps to treat diabetes, and it is possible that by changes in the level of BDNF protein in the central and peripheral nerves in aerobic exercise regimens, it can reduce complications of diabetes. BDNF and its receptor, tyrosine kinase B, are essential for learning and memory in the hippocampus. Among the neurotrophic factors, BDNF has the most significant role in learning and memory processes and synaptic flexibility. A long-term regular exercise is highly effective in reducing spatial memory loss caused by diabetes. Thus, it can be considered that the positive effect of exercise in modulating the complications of diabetes depends on its continuity and regularity (Mattson, Culmsee, Yu, & Camandola, 2000; Monti, Polazzi, & Contastabile, 2009).
5. Conclusions
According to our results, it can be concluded that the use of RPH hydro-alcoholic extract and aerobic training alone and simultaneously can improve passive avoidance memory in male diabetic rats. It might be considered as an adjuvant therapy with other traditional anti-diabetic medications. Nevertheless, further studies are necessary to indicate the probable mechanisms of their effects.
تأثیر عصاره هیدروالکلی پوست پسته رسیده و تمرین هوازی
بر یادگیری و حافظه موشهای صحرایی نر دیابتی ناشی از استرپتوزوتوسین
نقش ورزش و گیاهان دارویی بر سلامت بدن، هدف این مطالعه بررسی تأثیر تمرینات هوازی ترکیبی و استفاده از عصاره هیدروالکلی پوست پسته رسیده (RPH) بر یادگیری و حافظه موشهای صحرایی نر دیابتی شده با استرپتوزوتوسین بود.
روش بررسی:
در این مطالعه تجربی، 42 سر موش صحرایی نر نژاد ویستار با وزن 250 تا 280 گرم در 6 گروه با تعداد مساوی 7 موش در هر گروه مورد استفاده قرار گرفتند. برای القای دیابت از استرپتوزوتوسین (STZ) (50 میلی گرم بر کیلوگرم) استفاده شد و پروتکل آزمایش به مدت 8 هفته اعمال شد. حافظه اجتنابی غیرفعال با استفاده از دستگاه اجتناب غیرفعال مرحله-از طریق (جعبه شاتل) ارزیابی شد. برای تجزیه و تحلیل داده ها از نرم افزار SPSS استفاده شد و P<0.05 معنی دار بود.
یافتهها:
نتایج نشان داد که تأخیر مرحلهای در کارآزمایی اکتسابی (STLA) در بین گروهها تفاوت معنیداری نداشت. تأخیر گام به گام در آزمون بازیابی (STLr 24) به طور قابل توجهی کاهش یافت و زمان صرف شده در محفظه تاریک (TDC) در گروه های تحت درمان در مقایسه با گروه کنترل دیابتی کاهش یافت (001/0P<). همچنین بین گروه دیابتی STZ و سالین تفاوت معنی داری مشاهده نشد.
نتیجهگیری:
یافتههای این مطالعه نشان داد که عصاره هیدروالکلی RPH و ورزش هوازی میتواند حافظه اجتنابی غیرفعال را در موشهای صحرایی دیابتی با استرپتوزوتوسین بهبود بخشد. در همین حال، آنها ممکن است یک درمان کمکی همراه با سایر طب سنتی باشند.
1. معرفی
دیابت یکی از جدی ترین اختلالات غدد درون ریز است. تخمین زده می شود که تا سال 2011 بیش از 347 میلیون نفر در سراسر جهان از این بیماری رنج برده اند (دانایی و همکاران، 2011). سازمان بهداشت جهانی (WHO) پیش بینی کرده است که تعداد افراد مبتلا به دیابت در سال 2025 به 366 میلیون نفر افزایش خواهد یافت (Young et al., 1992). همچنین، WHO گزارش داد که نزدیک به 35.6 میلیون نفر با زوال عقل زندگی می کنند. پیش بینی می شود که این تعداد تا سال 2030 دو برابر شود (65.7 میلیون) و تا سال 2050 به بیش از سه برابر (115.4 میلیون) برسد (Ammari et al., 2018). سبک زندگی جدید شهرنشینی، ورزش نکردن و تغذیه ناسالم در کنار مصرف غذاهای چرب و شیرین از جمله عواملی است که باعث آسیب به سلامت، ابتلا به بیماری های متابولیک و از دست دادن جان انسان ها می شود. یکی از بیماری های متابولیک دیابت است. این یک بیماری خودایمنی است که در آن عوامل ژنتیکی، استرس محیطی، عفونتهای ویروسی و رژیم غذایی میتوانند باعث تخریب سلولهای بتا تولید کننده انسولین در پانکراس شوند. اختلال شناختی و غیر عادی سازی ترکیبات عصبی شیمیایی و ساختارهای مغز در بیماران دیابتی و موش های صحرایی دیابتی جوندگان با استرپتوزوتوسین (STZ) گزارش شده است (یانگ و همکاران، 1992؛ Ogonovszky و همکاران، 2005). علاوه بر این، حافظه و یادگیری، توانایی حل مسائل، سرعت ورزش، حرکات ذهنی و جسمی پیچیده، استنتاج و درک بیماران دیابتی آسیب می بیند (راماناتان و جیسوال، 1998).
مطالعات زیادی در مورد درمان دیابت با استفاده از گیاهان دارویی انجام شده است. اثرات محافظتی عصاره های گیاهی شامل زیره، شنبلیله، مریم گلی، خزه و غیره در موش های صحرایی دیابتی تایید شده است (شهبازی و ملک نیا، 2008). پسته یکی از پرمصرف ترین گیاهان دارویی در طب سنتی است. هال بزرگترین محصول جانبی پسته است (به طور متوسط بین 35 تا 45 درصد در طی فرآوری صنعتی پس از برداشت تولید می شود (گریس و همکاران، 2016؛ بارکا و همکاران، 2016). گزارش شده است که عصاره اتانولی پوست پسته رسیده (RPH) حاوی تنوع زیادی از اسید فنولیک، فلاونوئیدها، فلاونول ها، فلاون ها و فلاونول ها است (Barreca et al., 2016). بر اساس ترکیبات آن، RPH می تواند یک منبع مقرون به صرفه از ترکیبات با پتانسیل محافظت از سلامت باشد. همچنین، مشتق فنلی RPH ممکن است به عنوان یک جایگزین طبیعی برای آنتی اکسیدان های مصنوعی استفاده شود (گریس و همکاران، 2016؛ Sevcan، Ozlem، Reinhold، و Ralf، 2017). نقش فلاونوئیدها در تقویت حافظه نشان داده شده است (نیشیمورا، تاکی و تاکایشی، 2000). تمرینات هوازی می تواند حافظه و یادگیری را بهبود بخشد (خلج و احمدی، 1395). همچنین، فعالیت بدنی نقش مهمی در مدیریت گلوکز خون و بر سلامت افراد مبتلا به دیابت و پیش دیابت دارد (Colberg et al., 2016). طی چندین دهه، یک ورزش در مدلهای انسانی و حیوانی میتواند به حفظ عملکردهای مغز مانند عملکرد شناختی کمک کند و حتی میتواند از سیستم عصبی مرکزی محافظت کند و عملکردهای یادگیری/حافظه را پس از ورزش مزمن بهبود بخشد (Yi, 2015). از آنجایی که ورزش و برخی گیاهان دارویی می توانند اثرات مفیدی بر حافظه موش های صحرایی دیابتی داشته باشند، مطالعه حاضر با هدف بررسی تأثیر عصاره هیدروالکلی RPH و ورزش هوازی بر یادگیری و حافظه موش های صحرایی نر دیابتی STZ انجام شد.
2. مواد و روش ها
2.1. مواد شیمیایی و تهیه عصاره هیدروالکلی RPH STZ از سیگما آلدریچ (سنت لوئیس، MO، ایالات متحده آمریکا) خریداری و در سالین حل شد. آجیل پسته رسیده (Pistacia vera, L.) رقم اوحدی از درختان 13 ساله کشت شده در منطقه دامغان استان سمنان در سال 1392 به دست آمد. این گیاهان توسط دانشیار داوود بخشی تایید شد. (پومولوژیست، دانشکده کشاورزی، دانشگاه گیلان، رشت، ایران.). دیواره میوه گوشتی پسته تازه و رسیده برداشته شد و در آون با دمای 40 درجه سانتی گراد خشک شد. 50 گرم از پودر ریز RPH با 70 درصد اتانول (70 درصد اتانول و 30 درصد آب مقطر) مخلوط شد و به مدت 72 ساعت روی انکوباتور شیکر با تکان دادن ملایم قرار گرفت. سپس فاز مایع ظرف روی قیف قرار داده شد و سپس خشک شد. عصاره خشک وزن شده و در نرمال سالین معلق شد. حیوانات با توجه به وزن و پروتکل خود مقدار مناسبی عصاره دریافت کردند. ضمناً تجويز عصاره در محلول سالين به روش گاواژ (ml/kg 10) انجام شد. دوزهای مختلف عصاره هیدروالکلی RPH (1، 5، 10، 50، 100 و 500 میلی گرم بر کیلوگرم) به مدت 2 ماه قبل از تمرین به صورت گاواژ به موش ها داده شد و تنها عصاره با دوز 10 میلی گرم بر کیلوگرم به طور معنی داری STLr 24 ساعت را در مقایسه با گروه سالین افزایش داد (05/0P<) و کاهش معنی داری در TDC نسبت به گروه شم و سالین داشت (به ترتیب 01/0P< و 05/0P<). بنابراین، دوز mg/kg 10 عصاره RPH به عنوان دوز موثر انتخاب شد.
2.2. حیوانات در این مطالعه تجربی، 42 سر موش صحرایی نر نژاد ویستار با وزن 250 تا 280 گرم (در هر گروه 7 عدد) مورد استفاده قرار گرفتند و در خانه حیوانات دانشگاه علوم پزشکی گیلان در دمای 2±20 درجه سانتی گراد نگهداری شدند. چرخه نور تا تاریکی 12 ساعت (شروع روشنایی در ساعت 9 صبح و شروع تاریکی در ساعت 9 شب) چهار موش در هر قفس با آب و غذای استاندارد موجود. همه آزمون های رفتاری از ساعت 10 صبح تا 4 بعد از ظهر انجام شد. تمام آزمایشات حیوانی مطابق با راهنمای مؤسسه ملی بهداشت برای مراقبت و استفاده از حیوانات آزمایشگاهی انجام شد. کلیه پروتکل ها نیز با دستورالعمل های اخلاقی و نظارتی کار با حیوانات آزمایشگاهی دانشگاه علوم پزشکی گیلان (کد: IR.GUMS.REC.1395.27) مورد تایید قرار گرفتند. قفس ها را دو بار در روز تمیز می کردند و در این مدت حیوانات را از نظر قند بررسی می کردند و اگر به مرز جنین می رسیدند به آنها انسولین تزریق می کردند. موش ها به طور تصادفی به شش گروه هفت تایی تقسیم شدند:
(1) گروه شم که شامل موش های غیر دیابتی بود و هیچ دارو یا ورزش دریافت نکرد.
(2) گروه STZ که شامل موش های دیابتی بود که هیچ دارویی دریافت نکردند یا ورزش)؛
(3) گروه دی آبتیک که نرمال سالین را به عنوان حلال RPH (STZ+Saline) دریافت کردند.
(4) گروه دیابتی که عصاره هیدروالکلی RPH (STZ+RPH) دریافت کردند.
(5) گروه دیابتی که به مدت 8 هفته در معرض دویدن روی تردمیل و 24 ساعت تمرین (STZ + ورزش) قرار گرفتند.
(6) گروه دیابتی که RPH عصاره هیدروالکلی را به همراه تمرینات هوازی دریافت کردند.
2.3. القای دیابت پس از کنترل و ثبت وزن، گلوکز داخل وریدی همه حیوانات با دستگاه قند سنج Accu Check اندازه گیری شد و سطح گلوکز خون ناشتا کمتر از 200 میلی گرم در دسی لیتر بدون ناشتا بود. سپس پس از 24 ساعت ناشتایی، دیابت با تزریق داخل صفاقی STZ با دوز 50 میلی گرم بر کیلوگرم القا شد (فیروزجایی، جعفری، اسکندری، انارکلی و علیپور، 1392). برای تزریق، STZ در محلول سرد سالین (1 میلیلیتر بر کیلوگرم) حل شد، در ساعت 8 صبح و در حالت ناشتا به موشها تزریق شد. سه روز (72 ساعت) پس از تزریق STZ، گلوکز خون در حیوانات کنترل شد. معیار برای موش های دیابتی سطح گلوکز خون بالای 250 میلی گرم در دسی لیتر در نظر گرفته شد. بنابراین، سایر حیوانات از مطالعه حذف شدند (فیروزجایی و همکاران، 2013؛ حسنین و شهیدی، 2012؛ جبارپور و همکاران، 2014).
2.4. تمرینات هوازی در ابتدا، موشها دوره سازگاری را با آسیاب موش پشت سر گذاشتند. در این دوره، دورههای آموزشی کوتاهمدت مکرر طی چهار روز متوالی (هر جلسه تمرین شامل یک دوره 5 دقیقهای 10 متر در دقیقه روزانه) استفاده شد. حیوانات آموزش ندیده پس از دوره سازگاری حذف شدند. یک روز استراحت در نظر گرفته شد و سپس مرحله اصلی تمرین آغاز شد. در هفته اول، حیوانات یک تردمیل با شیب صفر و سرعت 10 متر در دقیقه به مدت 10 دقیقه دویدند. در هفته دوم، پس از 5 دقیقه دویدن با سرعت 10 متر در دقیقه، سرعت با همان گرادیان صفر به 20 متر در دقیقه رسید و به مدت 10 دقیقه دوید. این دوره از تمرین به مدت 8 هفته ادامه یافت (ورما و بوردیا، 1998). پس از مدتی تمرین، حیوانات گروههای مختلف با استفاده از دستگاههای استاندارد یادگیری و حافظه مورد آزمایش قرار گرفتند.
2.5. یادگیری و حافظه اجتنابی غیرفعال پس از هشت هفته تمرین، یادگیری اجتنابی غیرفعال و حافظه گروه های مختلف دیابتی حیوانات با استفاده از دستگاه شاتل باکس خریداری شده از شرکت برج صنعت ارزیابی شد. ارزیابی حافظه بلند مدت بر اساس تقویت منفی انجام شد. این ابزار دارای دو محفظه، قسمت مکانیکی و کنترلر یا قسمت الکترونیکی بود. دو محفظه توسط یک در گیوتین 8*8 سانتی متری از هم جدا شده بودند. ابعاد هر اتاقک 20×21×20 سانتی متر بود. در کف هر یک از این دو محفظه، میله ها (قطر 2.5 میلی متر) به فاصله 1 سانتی متر از هم قرار گرفته اند که به عنوان شبکه ای برای انتقال برق گرفتگی به حیوان عمل می کند. بخش کنترل مدت، فرکانس و ضربه را در تنش تعیین می کند. مرحله عادت کردن شامل دو مرحله است که در فواصل 30 دقیقه انجام می شود. در این مرحله، موش در یک محفظه سفید قرار داده شد و درب گیوتین در 10 ثانیه باز شد و تاخیر گام به گام تا ورود حیوان به اتاق تاریک ثبت شد. هنگامی که حیوان وارد اتاق تاریک می شد، در گیوتین را می بستند و حیوان را از اتاق تاریک خارج می کردند و پس از هر مرحله حیوان را در قفس فردی خود قرار می دادند. تمرین 30 دقیقه پس از مرحله دوم عادتسازی انجام شد. بدین ترتیب موش در محفظه سفید قرار گرفت و پس از 10 ثانیه درب گیوتین بالا آمد. تأخیر مرحلهای (STL) حیوان ثبت شد و جریان الکتریکی به مدت 1 ثانیه با فرکانس 50 هرتز به مدت 2 ثانیه به پنجههای حیوان وارد شد و 120 ثانیه بعد تکرار شد. هنگامی که موش وارد اتاقک تاریک نشد، آزمایش متوقف شد. با این حال، شوک زمانی وارد شد که حیوان وارد اتاق تاریک شد. پس از سه آزمایش، اگر موش قادر به انجام کار نبود، از آزمایش حذف میشود. این مرحله 24 ساعت پس از تمرین برای ارزیابی حافظه بلند مدت انجام شد. آزمایش به مدت 10 دقیقه به طول انجامید. برای ثبت زمان مورد نظر برای آزمون از دو تایمر استفاده شد. ابتدا موش در یک محفظه سفید قرار داده شد و پس از 10 ثانیه درب گیوتین باز شد و تاخیر گام به گام حیوان به داخل محفظه تاریک ثبت شد. در نهایت، کل زمان سپری شده در اتاق تاریک (TDC) به مدت 10 دقیقه ثبت شد (فیروز جائی و همکاران، 2013). 2.6. تجزیه و تحلیل آماری داده ها با استفاده از نرم افزار SPSS مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. داده ها به صورت Mean±SEM نشان داده می شوند. برای اطمینان از توزیع نرمال داده ها از آزمون کولموگروف- اسمیرنوف استفاده شد. اگر توزیع نرمال بود، نتایج با استفاده از آنالیز واریانس یک طرفه (ANOVA) و به دنبال آن آزمون تعقیبی تاکی مقایسه شدند. در غیر این صورت از آزمون آماری کروسکال والیس استفاده شد. P<0.05 به عنوان سطح معنی داری در نظر گرفته شد.
3. نتایج
3.1. میزان تأخیر گام به گام در کارآزمایی اکتساب (STLa) نتایج نشان داد که STLA در گروه های شم، STZ+RPH، STZ+ورزش و STZ+RPH+ورزش در مقایسه با STZ و STZ+سالین افزایش یافته است. گروه ها، اما این تغییرات معنی دار نبودند.
3.2. تأخیر گام به گام در بازیابی (STLr) آزمون حافظه 24 ساعته پس از تمرین تفاوت معنی داری را بین گروه ها در STLr نشان داد (001/0P<). مقایسه درون گروهی تفاوت معنی داری بین STZ و گروه دیابتی سالین نشان نداد. از سوی دیگر، تفاوت معنی داری در گروه دیابتی STZ و سالین در مقایسه با گروه ورزش شم، STZ+RPH، STZ+ و STZ+ RPH+ ورزش وجود داشت (P<0.001).
3.3. مقایسه TDC درون گروهی تفاوت معنی داری را بین گروه دیابتی STZ و سالین نشان نداد. از سوی دیگر، در گروه دیابتی STZ و سالین در مقایسه با گروه ورزش شم، STZ+RPH، STZ+ورزش و STZ+RPH+تفاوت معنیداری وجود داشت (001/0P<).
4. بحث
در مطالعه حاضر، تأثیر عصاره هیدروالکلی RPH و تمرین هوازی بر یادگیری و حافظه موشهای صحرایی نر دیابتی ناشی از STZ مورد بررسی قرار گرفت. نتایج این مطالعه نشان داد که تمرین هوازی و عصاره هیدروالکلی RPH به تنهایی یا به صورت ترکیبی باعث بهبود نقص یادگیری و حافظه در موشهای دیابتی شد و بهبود حافظه در گروههای تحت درمان در مقایسه با گروه کنترل دیابتی معنیدار بود. دیابت ناشی از STZ عملکرد حافظه را کاهش می دهد (Flores-Gómez, de Jesús Gomez-Villalobos, & Flores, 2018). در مطالعات قبلی، کمبودهای یادگیری و حافظه در انسان و حیوانات دیابتی گزارش شده است (پاتیل، سینگ و کولکارنی، 2006؛ کوکوکاتای، آگار، گوموشلو، و یارگیک اوغلو، 2007). در تست حافظه، در موشهای دیابتی، تأخیر ورود به محفظه تاریک (STLr) کاهش و TDC افزایش یافت که نشاندهنده اختلال حافظه به دنبال دیابت است. افزایش STLr را نمی توان به اختلال حسی یا حرکتی حیوانات نسبت داد. زیرا مقدار STLA قبل از شوک الکتریکی تفاوت معنی داری بین گروه ها نشان نمی دهد. در پژوهش حاضر از دستگاه شاتل باکس برای اندازه گیری حافظه اجتنابی غیرفعال استفاده شد. تغذیه عصاره هیدروالکلی RPH با دوز 10 میلی گرم بر کیلوگرم باعث افزایش قابل توجه STLr و کاهش قابل توجه TDC در مقایسه با گروه کنترل دیابتی شد. این نتایج نشان داد که عصاره RPH باعث بهبود اختلال حافظه ناشی از دیابت در موشها میشود. ترکیبات فنلی در پسته با اثرات آنتی اکسیدانی، ضد التهابی و ضد میکروبی یافت شد (آزاددل، حناچی و صبورا، 2017). در مطالعات اپیدمیولوژیک ثابت شد که فلاونوئیدهای فنولیک به عنوان آنتی اکسیدان های موجود در پوست قرمز پسته، عملکرد حافظه را در موش های مسن تر به اثبات رسانده است (مزدستان، ابراهیم زاده و خلیلی، 2015). پوست قرمز پسته دارای ساختار پارانشیمی و فیبری است. همچنین از مواد معدنی مانند پتاسیم، منیزیم، کلسیم و سدیم تشکیل شده است. در همین حال، فلاونوئیدها ترکیبات مهمی در این گیاه هستند که می توانند فعالیت کولینرژیک را افزایش دهند (Zhang, Tang, Zheng, Chen, & Shen, 2011; Gao, Tang, He, & Bi, 2012) و یادگیری و حافظه (Thirugnanasambantham) و همکاران، 1990؛ ساولف، اوکلو و پری، 2004). همچنین ثابت شد که تحریک گیرنده استیل کولین حافظه و شناخت را افزایش می دهد (Baxter & Crimins, 2018) و به نظر می رسد که عصاره RPH حافظه را از طریق تقویت سیستم کولینرژیک افزایش می دهد.
مصرف غذاهای غنی از پلی فنول ها، از جمله فلاونوئیدها، تاثیر زیادی بر حفظ عملکرد مغز، بهبود یادگیری و توانایی حافظه دارد و همچنین به بهبود سیگنال های عصبی در شکل گیری حافظه کمک می کند. فلاونوئیدها دارای اثرات ضد اکسیدانی و ضد التهابی قوی هستند که می تواند روند کاهش عملکرد مغز به دلیل افزایش سن را کند کند. فلاونوئیدها می توانند جریان خون به مغز را بهبود بخشند و نقش مهمی در افزایش حافظه و توانایی یادگیری دارند. مکانیسمهای احتمالی تأثیر نویدهای فلاوو بر عملکرد مغز، فرآیندهای مؤثری برای بقای سلولی، تمایز و تشکیل حافظه هستند. مکانیسم اثر این ترکیبات در مغز متفاوت است. برخی به عنوان استروژن عمل میکنند و گروهی از طریق سیگنالدهی عصبی در کنترل مکانیسمهای مورفولوژیکی که بر شکلگیری حافظه تأثیر میگذارند، درگیر میشوند و در نتیجه آنزیمهای مؤثر در این مسیرها را قادر میسازند تا حافظه و توانایی یادگیری را افزایش دهند (ون، کمپرمن و گیج، 1999). گیاهان و غذاهای غنی از فلاونوئید می توانند حافظه و انعطاف پذیری سیناپسی را بهبود بخشند. فلاونوئیدها نقش مهمی در بهبود حافظه و عملکردهای عصبی شناختی انسان با محافظت از نورونهای آسیبپذیر، و همچنین افزایش عملکرد و بازسازی سلولهای عصبی موجود دارند (اسپنسر، 2008؛ ویگ جیانو و همکاران، 2006؛ وانگ، وانگ، وو، و. کای، 2006).
در این مطالعه، ورزش می تواند کمبود حافظه اجتنابی غیرفعال ناشی از دیابت را بهبود بخشد. همچنین، مصرف RPH اثر افزایشی ورزش بر حافظه را تقویت کرد. مطالعات مختلف اثرات مفید فعالیت بدنی و ورزش را بر عملکردهای مغز تایید کرده اند، مانند تقویت حافظه (گریلی، جان سون، و راشتون، 1999)، عملکرد شناختی (جوهانسون و اولسون، 1996)، نوروژنز (اولسون و جوهانسون). ، 1995) و بهبود آسیب های مغزی (Ogonovszky et al., 2005). ورزش، بدون اثرات نامطلوب، از سرکوب تکثیر سلولی ناشی از STZ در شیارهای سینوسی سینوسی مغز جلوگیری می کند و به نحوی ناهنجاری ها و عملکردها را بهبود می بخشد (Guo et al., 2008; Ding et al., 2005). مطالعات نشان داده اند که ورزش مقاومت مغز در برابر آسیب را بهبود می بخشد و فرآیندهای شناختی و حرکتی را بهبود می بخشد (راداک و همکاران، 2006؛ اسپیگلمن، 2013). تغییرات ساختاری و عملکردی در مغز نقش مهمی در بهبود حافظه و یادگیری در پاسخ به ورزش دارند (گوردون، بنسون، برد و فریزر، 2009). از آنجایی که ورزش باعث ایجاد نوروژنز در انسان می شود، خطر ابتلا به بیماری آلزایمر (هنریکسن، 2002)، بیماری پارکینسون و برخی دیگر از اختلالات عصبی را کاهش می دهد (هنریکسن، 2002؛ یوید و همکاران، 2009). ورزش باعث کاهش گلوکز خون می شود و این کاهش پس از ورزش با افزایش پاسخ سلول ها به انسولین و بهبود عملکرد انسولین همراه است (گوردون، بنسون، برد و فریزر، 2009). مطالعات قبلی نشان داده اند که ورزش می تواند بیان پروتئین های انتقال دهنده گلوکز (GLUT) را در عضلات اسکلتی افزایش دهد (هنریکسن، 2002). بنابراین، ورزش از طریق کاهش گلوکز خون باعث بهبود اختلال حافظه توسط STZ می شود. همچنین نشان داده شده است که ورزش به تغییر وضعیت آنتی اکسیدانی موش کمک می کند (Yuede et al., 2009). ورزش منظم و مداوم اثرات مفیدی بر مغز دارد. بر این اساس، ورزش باعث افزایش رشد مویرگی، اتصالات دندریتیک و پردازش در سیستم عصبی مرکزی می شود (کاتمن و برچتولد، 2006). علاوه بر این، ورزش منظم آسیب مغزی پس از سکته مغزی را کاهش می دهد (Carro, Trejo, Busiguina, & Torres-Aleman, 2001) و همچنین شدت بسیاری از بیماری های مرتبط با سن را کاهش می دهد. نشان داده شده است که ورزش هوازی از کاهش میزان ماده خاکستری و توانایی ذهنی در قشر قدیمی جلوگیری می کند (کولکامب و همکاران، 2004؛ بلومکوئیست و دانر، 1987؛ ایوانز و همکاران، 1993). ورزش طولانی مدت منجر به افزایش سطح آنتی اکسیدان ها و آنزیم های آنتی اکسیدانی می شود که می توانند از مغز در برابر آسیب اکسیداتیو محافظت کنند. به عنوان مثال، پس از یک ورزش طولانی مدت، سطوح مالون دی آلدئید (MDA)، محصول پراکسیداسیون لیپیدی و بیومارکر استرس اکسیداتیو، و اسید اسکوربیک در مغز به ترتیب کاهش و افزایش یافت (لیو و همکاران، 2000). ). اسید اسکوربیک، به عنوان یک اصلاح کننده عصبی، حافظه و اختلالات یادگیری ناشی از بیماری آلزایمر را بهبود می بخشد (هاریسون، حسینی، داوز، ویور و می، 2009). کاهش BDNF باعث ایجاد بیماری های عصبی مانند پارکینسون می شود. شدت متوسط تا زیاد تمرین باعث افزایش گیرنده های BDNF در مغز می شود که از تخریب عصبی جلوگیری می کند (Małczyńska, Pi otrowicz, Drabarek, Langfort, Małgorzata Chalimoniuk, 2019). ورزش از طریق کاهش گلوکز خون به درمان دیابت کمک می کند و ممکن است با تغییر سطح پروتئین BDNF در اعصاب مرکزی و محیطی در رژیم های ورزشی هوازی، عوارض دیابت را کاهش دهد. BDNF و گیرنده آن، تیروزین کیناز B، برای یادگیری و حافظه در هیپوکامپ ضروری هستند. در بین عوامل نوروتروفیک، BDNF بیشترین نقش را در فرآیندهای یادگیری و حافظه و انعطاف سیناپسی دارد. یک ورزش منظم طولانی مدت در کاهش از دست دادن حافظه فضایی ناشی از دیابت بسیار موثر است. بنابراین، می توان در نظر گرفت که تأثیر مثبت ورزش در تعدیل عوارض دیابت به تداوم و منظم بودن آن بستگی دارد (Mattson, Culmsee, Yu, & Camandola, 2000; Monti, Polazzi, & Contastabile, 2009).
5. نتیجه گیری ها
با توجه به نتایج ما می توان نتیجه ای را که از عصاره هیدروالکلی RPH استفاده کرد و تمرین هوازی به تنهایی را گرفت و در نتیجه می توان از آن جلوگیری کرد غیرفعال را در موش های صحرایی نر حفظی بهبود بخشد. ممکن است به عنوان یک درمان کمکی با سایر داروهای سنتی ضد مصرف در نظر گرفته شود. با این وجود، مطالعات بیشتر برای نشان دادن مکانیسم های احتمالی وجود دارد.